リン酸化アッセイに関する質問集

質問 ID: 2754

[Bio-Plex Phosphoprotein Assay] リン酸化(の割合)の評価はどのように行えばよいですか。

回答

一例としては以下のような測定・評価方法があります。

(A) 総タンパク量あるいは一定細胞数あたりの目的タンパク質のリン酸化量比だけの評価を行う場合(目的タンパク質量の増減を考慮に入れない場合)

1) 総タンパク量(総タンパク濃度)あるいは総細胞数を揃えて各サンプルを調製し、マニュアルに従ってBio-Plex Phosphoprotein アッセイを行います。

2) 対象サンプル(薬剤処理したサンプル、一定時間経過したサンプルなど)のMFI値をコントロールサンプル(薬剤未処理サンプル、未処置サンプルなど)のMFI値で割り算することで目的タンパク質のリン酸化量比を算出することができます。


(B) 一定目的タンパク質量あたりの目的タンパク質のリン酸化量比の評価を行う場合(目的タンパク質量の増減を考慮に入れる場合)

1) 総タンパク量(総タンパク濃度)あるいは総細胞数を揃えて各サンプルを調製し、マニュアルに従ってBio-Plex Phosphoprotein アッセイ及びTotal protein アッセイを行います。Total protein アッセイの中に目的タンパク質がない場合は、目的のタンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、バンドの濃さを比較します。

2) Bio-Plex Phosphoprotein アッセイ及びTotal protein アッセイについて、対象サンプル(薬剤処理したサンプル、一定時間経過したサンプルなど)のMFI値をコントロールサンプル(薬剤未処理サンプル、未処置サンプルなど)のMFI値で割り算することで目的タンパク質のリン酸化量比及びタンパク量比を算出します。
Total protein アッセイの中に目的タンパク質がない場合は、目的のタンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、バンドの濃さを比較しタンパク量比を算出します。

3) 先ほど算出したリン酸化量比をタンパク量比で割り算することで、一定目的タンパク質量あたりの目的タンパク質のリン酸化量比が算出されます。

#こうした解析において、複数項目のTotal ProteinのMFI値の相乗平均を求め、ウェル間(サンプル間)のサンプルアプライ量のNomalizeに使用している論文報告例もあります。

関連項目