このコーナーでは、定期的にバイオ・ラッドの新製品や技術情報のトピックをご紹介します。

ELISA(Enzyme Linked Immunosolvent Assay)とは、特異的な抗原抗体反応および酵素反応を利用して、サンプル中の目的物質の有無や存在量を求める実験手法です。主に、96ウェルフォーマットのマイクロプレートやストリップウェルを用いますが、バイオ・ラッドでは、長年に渡り、マイクロプレートウォッシャーやマイクロプレートリーダーをご提供しています。また、ELISAを学べる教育用キット ELISAイムノExplorerキットがあります。
さらに、研究目的で獣医学分野抗体医薬品の開発分野(抗イディオタイプ抗体)などでのELISA法に利用できる抗体を多数ラインアップしています。

ELISA と言ってもいくつかの方法があり、その目的や入手可能な抗体によって使い分けます。
今回はELISA ガイドブックから、各種ELISAの原理をはじめ、長所と短所を紹介します。

直接法
(direct ELISA)
間接法
(indirect ELISA)
サンドイッチ法
(sandwitch ELISA)
競合法
(competitive ELISA)

 

直接法(direct ELISA):直接吸着-直接標識法

直接ELISA(direct ELISA)法では、一般的には一種類の抗原(緑色丸で表示)をマイクロプレートに固相化します。その後、HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)などの酵素(ピンク色の丸で表示)を直接標識した抗体で検出を行います。

Fig. 1. Overview of direct ELISA.

利点・メリット 欠点・デメリット
  • 手順が少ないため、他の方法よりも迅速
  • 使用する試薬の種類やステップが少ないため、間違いが少ない。
  • 目的とするタンパク質を含め、サンプル中のすべてのタンパク質がプレートに結合する。抗原の固相化が非特異的であるため、サンドイッチ法(後述, 特異抗体により捕捉する)と比較してバックグラウンドが高くなる可能性がある。
  • 個々の抗原に対する酵素標識抗体が必要なため、アッセイ系を構築しにくい。市販の標識抗体を入手するか、自身で標識する必要がある。
  • シグナルの増幅を行わないため、感度が劣る

 

間接法(indirect ELISA):直接吸着-間接標識法

indirect ELISAでは、抗原をプレートに直接吸着し、検出を2段階で行います。抗原に特異的な非標識一次抗体(多くの場合はモノクローナル抗体)を結合し、その後、酵素標識した二次抗体(一次抗体に対する抗体、多くの場合はポリクローナル抗体)を加えます。

Fig. 2. Overview of indirect ELISA.

利点・メリット 欠点・デメリット
  • 一つの一次抗体に対して複数の二次抗体(ポリクローナル抗体の場合)が結合するため、シグナルが増幅され感度が高い。
  • 標識抗体を、抗原ごとに多種類用意する必要がないため経済的
  • 一種類の標識二次抗体を、異なる一次抗体に使用できるため、アッセイ系を構築しやすい
  • 二次抗体が交差反応する場合があり、バックグラウンドノイズがある場合がある。
  • 直接法と比べると、二次抗体のインキュベーションステップが加わるため、操作に時間を要する。

このフォーマットは、サンプル中に含まれる抗体(上図では黒で示されている抗体に相当)の量を求める際にも用いられます。

indirect ELISAの具体的なプロトコールの例はこちらをご参照ください。

 

サンドイッチ法(direct sandwich ELISA)

サンドイッチELISAでは、キャプチャー抗体と検出抗体からなる抗体ペア(Matched Antibody Pair)が必要です。正確な結果を求めるためには、使用する抗体ペアが、目的の抗原の異なるエピトープに結合するかを確認しておくことが重要です。

サンドイッチELISAでは、まずポリスチレン製のマイクロプレートにキャプチャー抗体をコーティングします。次に、サンプルを加えてインキュベーションします。洗浄後、検出抗体を加えます。検出抗体には酵素標識したものを使うこと(direct sandwich ELISA,図左)が可能であり、また、検出抗体が標識されていない場合には、二次抗体として標識された抗体を用いること(indrect sandwich ELISA,図右)も可能です。

サンドイッチELISAには、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用可能ですが、キャプチャー抗体にポリクローナル抗体を使うことで、多くの抗原を捉えることができます。

Fig. 3. Overview of direct sandwich ELISA.

利点・メリット 欠点・デメリット
  • 直接法や間接法と比べて、2-5倍高感度
  • 抗原の捕捉と検出に、二種類の抗体を使うため、特異性が高い。
  • 目的とする抗原を測定前に精製する必要がないため、混合物サンプルの解析に適している
  • 検出に直接標識法と間接標識法を用いることができるので、アッセイ系の構築がフレキシブルである。
  • キャプチャー抗体と検出抗体の間での交差性を減らすことが重要であり、標準化済みのELISA用のキットあるいは確認済みの抗体ペアを用いる必要がある。もし、そうでない場合には、抗体の最適化を行う必要があるが、それが困難な場合がある。

 

競合法・阻害法(Competition ELISA)

競合ELISAは、ELISA法の中ではおそらく最も複雑な手法です。上述の各種の手法は競合法に改変することも可能です。 競合ELISAでは、溶液中に抗原がない場合の反応シグナルと比べ、サンプル中に存在する抗原による競合反応を検出することで濃度測定を行います。つまり、サンプル中の抗原濃度が高いとシグナルは弱くなります。これはサンプル中の抗原量に応じてシグナルが逆相関することを意味しています。

下図では、上述した直接法をベースにして、サンプル中の抗原を検出するための競合法の例を示しています。この例では、まず、精製された抗原(緑丸で表示)をマイクロプレートにコートしておきます。ブロッキングと洗浄操作の後、未知量の抗原(青丸)を含むサンプルを加えます。検出のために酵素標識抗体を加えますが、サンプル中にも抗原(青丸)があると、それに標識抗体が結合してしまうため、この後の洗浄ステップで除去されます。反応基質を加えると、プレート上の抗原(緑丸)に結合した標識抗体の量に応じたシグナルを検出します。

もしサンプル中の抗原濃度が高い場合、観察されるシグナルは大きく減少します。逆に、サンプル中に抗原が少ないときには、シグナル低下の程度は少なくなります。

Fig. 4. Competition ELISA.

利点・メリット 欠点・デメリット
  • 目的とする抗原タンパク質に対して、一つしか抗体がない場合に用いられる。サンドイッチ法で必要な2種類の抗体を結合できないような低分子の抗原の検出にも用いられる(*下記注釈参照)。
  • 直接(吸着法)と比較し、サンプルの処理が必要がなく、クルードなサンプルや目的のタンパク質以外を含むサンプルも使用可能。
  • 直接法、間接法、サンドイッチ法をベースにして、アッセイ系を構築することも可能
  • それぞれのELISA法は競合法にすることが可能であるが、競合法にした場合にも、もとの方法でのデメリットがそのまま当てはまる。

*: 図示した直接吸着法ではなく、キャプチャー抗体で捕捉する場合、標識した抗原を用いて、サンプル中の非標識抗原の競合を利用します。

今回取り上げました様々なELISAフォーマットの解説の他、ELISAガイドブックでは、実際にELISA法を構築する際のプロトコールや最適化の考え方についても記載しています。

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