このコーナーでは、定期的にバイオ・ラッドの新製品や技術情報のトピックをご紹介します。

ウェスタンブロッティングでは、サンプル調製における不均一性、ピペッティング誤差、転写ムラなどの実験誤差が生じてしまう可能性があるため、定量的な解析に際しては適切なLoading Control (ローディングコントロール) による補正を行って比較することが望ましいとされています。
一般にはLoading Controlとして、House Keeping Protein(ハウスキーピングタンパク質) と呼ばれるアクチン、チューブリン、GAPDH 等が良く用いられますが、あくまでこれらの発現量が一定であるという前提に基づくものとなります。しかし、必ずしもHouse Keeping Proteinの発現量は一定とは限らず、下図の例のようにサンプル間でHouse Keeping Proteinが変動してしまうケースもあります。そのため、House Keeping ProteinをLoading Controlとする場合は、あらかじめ発現の安定性を予備実験で確認しておくことが推奨されています(バックナンバー参照)。

最近ではHouse Keeping Proteinに代わるLoading Controlとして、総タンパク質染色が見直されつつあります。中でもバイオ・ラッドのStain-Freeゲルは、泳動後のゲルをUV照射するだけで総タンパク質染色の画像を取得することができ、ライセートサンプルを泳動する一般的なタンパク量のレンジ(10-50ug)で、高い直線性のあるシグナルが得られます。また、総タンパク質染色ではサンプル毎に安定性を確認する予備実験も不要となります。 Journal of Biological Chemistry (JBC) への論文投稿の指針においても、Loading Controlとして定量性のある総タンパク質染色が推奨されており(下表)、Stain-Freeはまさに理想的なLoading Controlと言えるのではないでしょうか?

以上のような、定量的なウェスタンブロッティングにおけるLoading Controlデータ補正や主要科学雑誌への投稿指針に関する英文資料は、こちらのリンクをご参照ください。

がん組織と非がん組織におけるHouse Keeping Protein発現レベルの変動例
定量的なウェスタンブロッティングに関するJBCガイドラインと対応策
JBC ガイドライン ガイドラインへの対応策 Bio-Rad のソリューション
"Housekeeping proteins should not be used for normalization without evidence that experimental manipulations do not affect their expression" House Keeping Proteinの代わりに総タンパク質染色によるデータ補正を採用する Stain-Free ゲルを用いた総タンパク質データ補正のワークフロー(すでに100報以上の論文実績)
"Methods including detection of enhanced chemiluminescence using X-ray film have a very limited dynamic range" ダイナミックレンジの広い検出システムを採用する(>4 logs) 高感度でStain-Free撮影にも対応したChemiDoc Touch システム
定量的解析機能に優れたImageLabソフトウェア
"A description of the data supporting the specificity of all antibodies is required" 検証済の抗体を採用する 検証済のPrecisionAb 抗体
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