サンプル中の死細胞の存在は染色性に大きく影響し、さらにはデータの品質にも影響します。 これは、死細胞がより強い自家蛍光を発し、非特異的な抗体結合も多いため、偽陽性(False Positive)の原因となり、ダイナミックレンジ(Dynamic Range)を減少させるためです。 そのため、弱陽性のサンプルや存在比率の少ない集団の同定を困難にします。 前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)に基づいたゲートを使用することで、細胞片(debris)や死細胞を取り除くこともできますが、すべてを除去はできません。 このため、死細胞と生細胞を区別するための色素が開発されています。

核酸結合色素(Nucleic Acid Binding Dyes)

生存率試薬のグループの一つは、核酸結合色素です。 このグループには488nmおよび561nmレーザーの両方によって励起可能なropidium Iodide（PI）および7-AADが含まれます。 それらは二本鎖核酸に結合すると蛍光を発します。 これらの色素は膜透過性ではないため、生細胞では排除されます。 抗体での染色後、サンプルに直接添加し、簡単にインキュベートすることで細胞に取り込まれます。 次いで、染色されていない集団（生細胞）をゲーティングすることで、死んだ細胞は解析対象から除去されます。 この方法は、生きた細胞の細胞膜が色素を通さないことによるため、固定処理をしたサンプルには使えません。

図24. Live/Dead染色の使用による染色の改善 (Using a live/dead stain can improve your staining)
A.前方散乱および側方散乱ゲーティング（赤色の四角形）を使用しても、死んだ細胞はすべて除去されず、依然として非特異的結合が存在する可能性があります。
B. Propidium Iodide（PI）染色（赤色四角形）を用いて死細胞を除外することで、非特異的結合を低減し、陽性染色集団を同定しやすくなります。 ここに示された画像は、CD14およびCD3で染色されたヒト末梢血です。

タンパク質結合色素(Protein Binding Dyes)

サンプルから死細胞を区別するために利用可能な生存性色素(Viability Dye)の2つめのグループは、DNA結合色素ではなくタンパク質に共有結合する色素です。 これらの色素は、生細胞と死細胞の両方に結合します（図25）。 しかし、死細胞や死にかけている細胞は細胞膜が傷ついているため、色素が細胞内に浸透してより多くの量のタンパク質と結合するため、より高い蛍光を発します。 DNA結合色素と同様に、染色されていない集団（生細胞）をゲーティングすることによって、死細胞を除去することができます。

図25.タンパク質結合生存性色素 (Protein binding viability dyes)
A.表面第一級アミンに結合した色素を有する生細胞
B.表面および細胞内第一級アミンに結合した色素を有する死細胞

これらの色素の利点は、色素がタンパク質に共有結合するため、生細胞と死細胞との間の分解能を低下させることなく染色後の細胞の固定や洗浄を行うことができることです（細胞を固定処理しないで使用することもできます。）。 さらに、DNA結合色素よりも幅広い励起および蛍光スペクトルの製品を選択できるため、マルチカラーフローサイトメトリーパネルへ組込み易いことも挙げられます。