免疫沈降実験で"役に立つ"検出試薬, TidyBlot™

免疫沈降実験（IP, Immunoprecipitation）や免疫共沈降実験(Co-IP, Co-immunoprecipitaion)では、沈降物をSDS-PAGEで分離した後、メンブレンに転写しますが、ターゲットのタンパク質の他にも、沈降する際に使用した抗体(イムノグロブリン)が変性した状態でメンブレン上に存在する場合があります。 こうしたイムノグロブリンのH鎖とL鎖は、それぞれおよそ50kDaと25kDaの位置にあり、ターゲット分子のサイズによっては検出をマスクしてしまったり、バックグラウンドを高めてしまう原因となりえます。

こうしたことを防ぐためには、以下のような工夫がされてきました。

• 沈降する際に使用した抗体がビーズから溶出しないように、マイルドな条件でターゲット分子を溶出する
  （SDS-PAGEサンプルバッファーではなく、酸性溶液で溶出）
• 沈降する際に使用した抗体がビーズから溶出しないように、ビーズ上のプロテインA/Gと抗体を架橋しておく
• 沈降する際に使用した抗体の生物種とは別の生物種由来の一次抗体を使用してウェスタンブロッティング検出を行う

また、血液サンプルや、脾臓・肝臓などといった組織の抽出液にも内在性の抗体が含まれることがあり、イムノブロッティングにおいては、内在性抗体のH鎖やL鎖がターゲットの検出を妨げることがあります。

今回紹介するTidyBlot™ Western Blot Detection Reagent:HRP(STAR209P) は、抗体の高次構造を認識するため、このような変性状態のH鎖やL鎖にはほとんど結合せず、ウェスタンブロッティング検出での一次抗体を特異的に認識します。 そのため、ウエスタンブロッティングにおいて二次抗体として使用することにより、ターゲットタンパク質をクリアーに検出することに役立ちます(図 1)。

しかも、様々な動物由来の一次抗体に結合するため、動物種ごとに複数の二次抗体を用意する必要がなく、汎用性の高い検出を行うことができます(図 2, 下表)。 免疫沈降実験でなくとも、いまお使いのHRP標識二次抗体をTidyBlot™ Western Blot Detection Reagent:HRPに替えて実験するだけです。

今回ご紹介した記事の全文はこちらからご覧いただけます。

• Problems with high background?:Tidy up your blot by changing to TidyBlot （PDFファイル）　
• TidyBlot Western blot detection reagentの製品紹介　
• TidyBlot Western blot detection reagentのよくあるご質問（PDFファイル）　
• バイオラッド抗体(旧AbD抗体)の検索サイト（日本語版サイト）　　

サンプル調製から最終の画像解析まで、ウェスタンブロッティングの各工程の原理や方法に加え、より掘り下げた実践的な情報をご提供いたします

ウェスタンブロット ラーニングセンターはこちらから。