リアルタイムPCRからDroplet Digital PCRへのアッセイ移行の検討方法

リアルタイムPCR (qPCR) とDroplet Digital PCR (ddPCR) これら2 つの PCR メソッドは、根本的に異なるアプローチを使用してサンプル DNA の濃度を測定します。今回紹介する資料ではこのメソッド間の移行実験での考慮すべき相違点と類似点を紹介しています。

ddPCR アッセイは多くはあらかじめ定量された標準物質を使用せずに、陽性コントロールと陰性コントロールのみで行われます。そのため、DNA の完全な増幅を確実に行うことが重要です。ここではqPCRからddPCRへの堅牢な移行を確実にするために使用される、いくつかの一般的な方法を示しています。
温度グラジェントによる条件検討とアンプリコンの外側をカットする制限酵素の追加は、アッセイをDroplet Digital PCRに移行する際に推奨される2つの一般的な最適化方法です。qPCR からddPCR への移行は容易であり、簡単な移行実験によって過去の qPCR データと直接比較できる一貫性のある堅牢な ddPCR 結果を得られるようになります。

温度グラジェント最適化データ。65℃〜55℃（左から右へ）の間でannealing/extension温度を変化させてPCR反応を行った代表的な1-Dドロップレットデータ(A)および濃度プロットデータ(B)を示す。
ポジティブドロップレットとネガティブドロップレットの分離は温度によって変化するが、ポジティブドロップレットとネガティブドロップレットの間に十分な分離があるため、温度に依存せず濃度は一貫している。

AAV2-CMV-GFPウイルス測定における制限酵素消化の効果 MspIの添加によりqPCRのCq値が低下し(B)、ddPCRでのウイルス濃度を増加させた(D)。

制限酵素無し MspI添加(5U/reaction)

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QX200 Droplet Digital PCR システム