このコーナーでは、定期的にバイオ・ラッドの新製品や技術情報のトピックをご紹介します。
本ページで紹介している製品はすべて研究用です。診断目的で使用することは出来ません。

フローサイトメトリー解析において蛍光色素の利用は欠かせませんが、特にマルチカラー解析では次のような光学特性をもつ蛍光色素が求められます。

  • 蛍光が明るい
  • 励起および蛍光スペクトルの幅が狭い
  • ストークスシフトが大きい

明るい色素を用いることで、存在数の少ない細胞や、発現量の少ないマーカーを識別することが容易になります。励起スペクトルが狭いことは異なるレーザーによる励起を抑制することとなり、また、蛍光スペクトルが狭いことで、異なる検出器への漏れこみを抑制することができます。 ストークスシフトとは励起波長と蛍光波長の差のことを言います。ストークスシフトが大きい蛍光色素を用いることで、一つのレーザー光源によって励起される蛍光色素の数を増やすことができ、多チャンネルのマルチカラー解析を容易にすることができます。

フローサイトメトリーで抗体標識に用いられる蛍光色素

抗体標識に用いられる蛍光色素にはいくつかに分類することができます。

(1) 低分子蛍光物質

  • FITCやCy DyesやAlexa Fluor Dyesなど

(2)蛍光タンパク質(Fluorescent Proteins)

  • GFPやYFP、mCHERRYなど。細胞内で共発現ないし、融合タンパク質として発現させるなどして使用します
  • R-Phycoerythrin (RPE、もしくはPE), Allophycocyanin (APC), and Peridinin chlorophyll (PerCP)など。藻類や植物から見出された蛍光タンパク質で、色素とタンパク質複合体
    # Phycoerythrin(PE)には、R-Phycoerythrin(RPE)の他、B-Phycoerythrin, C-Phycoerythrinがありますが、単にPhycoerythrinあるいはPEと書かれている場合、R-Phycoerythrinを意味します。

(3) タンデム蛍光色素(Tandem Dyes)

  • PEやPerCPなどと別の蛍光色素を共有結合で結合させたもの

(4) 蛍光ナノ粒子(fluorescent nanoparticles )など

タンデム色素とは

従来型のタンデム蛍光色素とは、二つの異なる蛍光色素を共有結合したものです。第一の色素(ドナー分子)を励起すると、そのエネルギーが第二の色素(アクセプター分子)に伝達されます。二番目の色素が活性化されると蛍光を生じます。このプロセスは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET; Förster resonance energy transfer)と呼ばれます。これにより、タンデム色素の分光特性は、ドナー蛍光色素の励起特性とアクセプター分子の発光特性を併せ持っています。

タンデム色素の利点

共通のドナー分子に対して、異なるアクセプター分子を結合することにより、大きなストークスシフトを実現し、単一のレーザーで分析できる蛍光の数を増やすことができます。他の蛍光物質とも組み合わせることにより、マルチカラーパネルに用いられます。
例えば、Alexa Fluor 488、Phycoerythrin (PE)、PE-Texas Red、Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP)-Cy5.5、は、いずれも488 nmで励起され、それぞれ緑、黄、赤、遠赤色光の蛍光を発しますが、これらは別々の検出器で測定することができます。

タンデム色素の注意点・使用ガイドライン

タンデム色素については,以下のガイドラインに従う必要があります。

  • タンデム色素は光退色の影響を非常に受けやすいので、常に光から保護する必要があります。
  • タンデム色素で標識した抗体は、決して凍結しないでください。
    凍結するとドナー色素が変性し、蛍光を発しなくなったり、減少したりすることがあります。
  • タンデム色素の輝度は、固定化や透過化によって低下することがあります。
    固定化や透過化が必要な場合は、できるだけ短時間で行うようにしてください。
  • タンデム色素はメーカー間や、バッチ間のばらつきが大きいため、バッチごとに最適化する必要があります。

StarBright Dyesとは

StarBright Dyesは、フローサイトメトリー用に開発された独自の蛍光ナノ粒子です。

色素同士の結合ではなく、重合反応で生成されたナノ粒子であり、安定した励起・発光特性を得ることができます。モノマーの種類と重合プロセスを変更することで、異なる蛍光を発する粒子を作ることができます。すでに488nmと405 nmのレーザーに対応した8種類の色素をリリースしており、今後さらに多くの色素を予定しています。様々なマルチカラーフローサイトメトリーパネルに柔軟に対応することができます。

下図は、488 nmレーザーによる励起による、StarBright Violetシリーズの蛍光特性を示しています。

StarBright Violetシリーズの蛍光特性
Click

リンク先の蛍光スペクトルビューアーで、お使いのフローサイトメーターにおける、蛍光特性を見比べてみてください。

今回の記事の関連情報
詳しいStarBright Dyeの情報は下記リンク先をご参照ください。
StarBright Dyes for Flow Cytometry
StarBright Dyes - フローサイトメトリー用蛍光色素-(日本語PDF)
日本語での情報
Antibodies Conjugated to Fluorophores
フローサイトメトリーBasicガイドより:
フローサイトメトリーにはどの蛍光色素が適しているのか?:蛍光色素の例
蛍光: ストークスシフトの解説など
記事に関連する製品の紹介ページ
フローサイトメトリーでの使用実績があるバイオ・ラッドの抗体のStarBright標識製品(日本語サイト)
バイオ・ラッドの抗体検索サイト(日本語)価格やキャンペーンはこちらから確認ください。
バイオ・ラッドの抗体検索サイト(英語)製品の詳しい情報はこちらでご確認ください。
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バイオ・ラッド テックコール
life_ps_jp@bio-rad.com,
03-6404-0331(平日9:00-17:00)

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