リン酸化タンパク質のウェスタンブロッティングにおける10のポイント

タンパク質のリン酸化は、細胞内のシグナル伝達において重要な役割を果たしており、がん等の疾患メカニズムの理解のためにも主要な研究対象となっています。しかし、ウェスタンブロッティングでリン酸化タンパク質を定量的に検出するには、サンプル調製の段階から注意すべき点が多くあります。バイオ・ラッドでは、ウェスタンブロッティングによるリン酸化の解析において必要な10のポイントをまとめてみました。

特に「10. 総タンパク質量による補正(TPN, Total Protein Normalization)」は重要なポイントであり、JBC (Journal of Biological Chemistry) への投稿の指針においても、ターゲットのトータルシグナル強度や総タンパク質量でデータを補正することが推奨されています。バイオ・ラッドの Stain-Free ゲルとChemiDoc Touch（または XRS Plus）を使用すれば、メンブレンの総タンパク質染色イメージを簡便に取得することができ、ImageLabソフトウェアにより総タンパク質量による補正も簡単に行うことができます。定量性の高いデータ補正が可能な Stain-Free ゲルは、リン酸化タンパク質のウェスタンブロッティングにおいても強力な実験ツールとなります。

1. タンパク質分解や脱リン酸化反応の予防
2. リン酸化を特異的に検出できる抗体の選択
3. ターゲットタンパク質のトータル検出用抗体の併用
4. リン酸化の誘導
5. フォスファターゼ処理による脱リン酸化の確認
6. サンプルの濃縮
7. ブロッキング条件の最適化
8. メンブレンの選択
9. 洗浄方法の選択
10. 総タンパク質量による補正 (TPN: Total Protein Normalization)

ウェスタンブロッティングによるEGFレセプターのリン酸化の検出

　

　

EGF刺激したA431細胞のライセートと未刺激のライセートを電気泳動し、一次抗体として (A) Mouse Anti-EGF R 抗体 (VMA00061) または (B) Mouse Anti-EGF R (pTyr1148) 抗体(VMA00751) を、二次抗体として Goat Anti-Mouse IgG-HRP標識 (#STAR207P) を用いてウェスタンブロッティングを行った。Lambda Phosphatase 処理によってリン酸化バンドが消失することから、リン酸化を特異的に検出していることをサポートするデータとなっている。

サンプル調製から最終の画像解析まで、ウェスタンブロッティングの各工程の原理や方法に加え、より掘り下げた実践的な情報をご提供いたします

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